诺米代谢项目文章荣登Small杂志|多组学联用揭示协同免疫治疗新途径！

发布日期：2020-05-11 00:00　　 来源：帕诺米克代谢组学订阅号　　 阅读： 987


血小板修饰磁性纳米颗粒介导铁死亡增强的肿瘤免疫治疗


期刊名：Small, IF=10.856

技术平台：脂质组学、定量蛋白组学

合作单位：复旦大学

发表时间：2020.04


      免疫治疗和免疫检查点阻断疗法是非常有前景的治疗手法。然而，由于肿瘤微环境的复杂性和宿主免疫系统的钝化，免疫治疗策略在许多癌症的抗肿瘤反应中仍然存在局限性。通过其他免疫原性疗法与检查点阻断疗法联合可提供非炎症肿瘤的免疫应答率。因此，开发有效的抗肿瘤诱导和免疫调节的新途径和策略，对免疫治疗具有重要意义。

      铁死亡是近年来发现的一种新的细胞死亡形式，它能有效抑制肿瘤生长，并适当产生免疫原性，而具有免疫逃避和肿瘤靶向能力的血小板膜包衣的纳米颗粒可以最大限度将诱导铁死亡的药物递送到肿瘤，从而在肿瘤转移的铁死亡治疗中发挥出完全的潜力。作者发明了一种血小板膜包衣载有柳氮磺吡啶的介孔磁性纳米颗粒(Fe3O4-SAS@PLT)诱导铁死亡和PD-1免疫检查点阻断疗法结合的铁死亡增强肿瘤免疫治疗策略(方案1)。


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方案1. 血小板膜修饰磁性纳米颗粒增强肿瘤免疫治疗的示意图


研究路线

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Fe3O4-SAS@PLT诱导细胞毒性及其铁死亡机制

    用不同浓度的Fe3O4-SAS@PLT处理肿瘤4T1细胞，测定了Fe3O4-SAS@PLT对4T1细胞的体外细胞毒性。Fe3O4和SAS对4T1细胞无明显的细胞毒作用。且Fe3O4-SAS@PLT和Fe3O4-SAS均以剂量依赖的方式降低细胞活力(图 2a)。为了探讨Fe3O4-SAS@PLT抑制肿瘤细胞活力的机制，使用3种抑制剂研究引起细胞凋亡，坏死和自噬的三种常见死亡模式，发现Fe3O4-SAS@PLT没有诱导4T1细胞凋亡，坏死或自噬。

    考察了铁死亡抑制剂Fer-1和铁螯合剂去铁胺DFO对经Fe3O4-SAS@PLT处理的4T1细胞活力和活性氧水平的影响。结果显示Fer-1和DFO均能显著降低细胞毒性(图 2b), 提示Fe3O4-SAS@PLT可能参与了铁死亡诱导的细胞死亡。另外Fer-1和DFO对Fe3O4-SAS@PLT处理的细胞ROS水平均显著下调(图 2c), 表明Fe3O4-SAS@PLT处理的细胞发生铁死亡。

    Fe3O4-SAS@PLT能显著提高4T1细胞内脂质过氧化水平，而Fer-1或DFO可显著抑制脂质过氧化作用(图 2e)，说明Fe3O4-SAS@PLT产生脂质过氧化产物。此外，Fe3O4-SAS@PLT引起的细胞内谷胱甘肽耗竭可被Fer-1或DFO显著降低(图 2f)。谷胱甘肽的耗竭表明Fe3O4-SAS@PLT可能通过抑制半胱氨酸进入细胞合成谷胱甘肽的系统Xc-转运体(XcT)途径诱导铁死亡。为了验证这一假说，通过免疫印迹法检测了细胞内的XcT和下游谷胱甘肽过氧化物酶4 (GPX4)的表达，这可能受谷胱甘肽耗竭的影响。Fe3O4-SAS@PLT处理显著降低了4T1细胞内的XcT水平和GPX4水平(图 2g)。


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图2. Fe3O4-SAS@PLT体外细胞毒性及铁死亡机制的研究


    脂质过氧化物是铁死亡发生的重要标志物，采用LC-MS检测Fe3O4-SAS@PLT处理后4T1细胞内脂质的变化。成功鉴定了300种脂质(图 3a)。在Fe3O4-SAS@PLT处理后，4T1细胞中有多种含氧多不饱和磷脂的含量显著升高，提示脂质的过氧化发生(图 3b)。其中，PE, PC, PG, PS和PI五类磷脂的含氧化物升高尤为显著(图 3c)。不同种类的溶血磷脂的水平显著升高(图 3d和e)，这些结果表明Fe3O4-SAS@PLT诱导的细胞死亡涉及脂质过氧化物积累，表明铁死亡确实是Fe3O4-SAS@PLT诱导细胞死亡的主要途径。


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图3. Fe3O4-SAS@PLT处理后4T1细胞脂质组学研究


Fe3O4-SAS@PLT介导的铁死亡体内免疫激活

    用不同材料对Balb/c转移模型小鼠进行治疗(图4a)，验证Fe3O4-SAS@PLT诱导的铁死亡在小鼠体内发生，首先检测了肺转移瘤组织中GPX4的表达(图4b)。Fe3O4-SAS@PLT组的肺转移瘤组织中GPX4表达显著降低。但加入铁死亡抑制剂后，GPX4的表达有所回升，表明Fe3O4-SAS@PLT治疗的转移瘤中存在铁死亡。

    收集24小时(第8天)的淋巴结，分析树突细胞的成熟(图4c)，Fe3O4-SAS@PLT组小鼠淋巴结成熟树突细胞表达CD86+/CD80+阳性。而Fe3O4-SAS@PLT组小鼠加入Fer-1或DFO后，淋巴结成熟树突细胞的百分率显著下降。这些结果表明Fe3O4-SAS@PLT介导的铁死亡促进了树突细胞的成熟。检测了治疗后小鼠血清中的各种细胞因子(TNF-a, IL-6 和IL-12p70)。发现Fe3O4-SAS@PLT诱导小鼠体内的良好免疫反应是由Fe3O4-SAS@PLT介导的铁死亡引起的。综上所述，这些结果提示Fe3O4-SAS@PLT介导的铁死亡可以在体内释放肿瘤相关抗原并触发有效的免疫激活。


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图4. Fe3O4-SAS@PLT在体内诱导免疫应答


Fe3O4-SAS@PLT介导的铁死亡加PD-1阻断剂抗转移瘤的体内疗效

    用荧光标记4T1细胞(4T1-luc)注射到小鼠体内，发现4T1细胞在小鼠肺部发生转移(图 5a)。Fe3O4-SAS@PLT显示了体内靶向转移4T1细胞的能力，在肝、脾、肺中的富集程度高于其他器官(图 5b)，表明Fe3O4-SAS@PLT在体内具有显著的转移瘤靶向性。

    为了评估Fe3O4-SAS@PLT介导的铁死亡和PD-1免疫检查点阻断疗法联合策略的有效性，4T1转移瘤小鼠接受了不同纳米材料的治疗(图 5c)。监测肿瘤转移的扩展和生长和转移(图 5d和e)。用联合策略治疗的小鼠几乎没有发光，表明肿瘤转移被显著抑制，且肺转移结节少于对照(图 5f)，存活率高于对照(图 5g)。结果表明联合治疗可以有效抑制肿瘤转移，且在延长小鼠生存期方面具有显著优势。

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图5. Fe3O4-SAS@PLT介导的铁死亡联合抗PD -1免疫治疗对4T1转移瘤小鼠的抗转移作用


Fe3O4-SAS@PLT介导的铁死亡增强肿瘤免疫治疗的机制研究

    对Fe3O4-SAS@PLT治疗前后的肿瘤进行了基于TMT质谱的蛋白组学分析探究。结果表明Fe3O4-SAS@PLT显著降低了Slc3a2和Slc12a7蛋白表达(图 6a和b)，说明肿瘤组织被CD8+ T细胞高度浸润。且CD4+ T细胞相关的蛋白表达也有显著差异，高得Irf4表达和低的Pglyrp1或Ikzf2表达与CD4+效应T细胞信号呈正相关，表明肿瘤组织中的CD4+ T细胞被Fe3O4-SAS@PLT激活。综上所述，Fe3O4-SAS@PLT介导的铁死亡能激活DC成熟、T细胞活化和浸润，从而促进PD-1治疗。

    作者研究了免疫功能相关102个差异表达蛋白(图 6c)，主要参与了细胞杀伤调节，抗原刺激炎症调节，原生防御反应，T细胞介导免疫等(图 6d), 揭示了经Fe3O4-SAS@PLT治疗后，与肿瘤相关的特异性免疫途径被激活，最具代表性的过程包括肿瘤坏死因子(TNF)信号途径，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号途径，白细胞介素(IL-17)信号途径和趋化因子信号途径(图 6e)，它们是免疫系统激活的重要途径。

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图6. Fe3O4-SAS@PLT介导的上铁死亡增强抗肿瘤免疫反应的机制


结论

    本研究发明了一种仿生磁性纳米颗粒(Fe3O4-SAS@PLT)介导铁死亡和提高肿瘤免疫治疗疗效。有血小板的自我识别特性，Fe3O4-SAS@PLT纳米粒表现出有效的免疫逃逸和靶向富集肿瘤转移靶点。Fe3O4-SAS@PLT纳米粒不仅可以通过抑制系统XcT通路诱导铁依赖的铁死亡发生，而且可以诱导有效的免疫反应，提高PD-1阻断疗法的体内治疗效果。相比于单一治疗方式，Fe3O4-SAS@PLT介导的铁死亡联合免疫治疗有效抑制了肿瘤的生长和转移，提供了一种临床适用的协同免疫治疗的新途径。


参考文献

Qin Jiang et al. Platelet Membrane-Camouflaged Magnetic Nanoparticles for Ferroptosis-Enhanced Cancer Immunotherapy [J] small,2020



项目文章下载：

Platelet Membrane-Camouflaged Magnetic Nanoparticles for Ferroptosis-Enhanced Cancer Immunotherapy.pdf