【帕诺米克】代谢组检测项目样本制备要求汇总(建议收藏)

发布日期:2019-09-18 00:00   来源:帕诺米克微信公众号   阅读: 64

      样本制备的质量对于实验结果会产生直接影响,也是实验中非常重要的环节,帕诺米克对不同来源、不同类型、不同项目的样本制备要求进行了总结,方便各位老师参考。




      1. 血液(血浆/血清)

      血液样本是代谢组学研究中常见的生物样本,血液样本采集方法主要分为临床采血方式和动物采血方式,临床采血方式主要有静脉采血法、皮肤采血法、动脉采血法;动物采血方式主要包括采集实验动物的尾部、眼眶静脉丛、颈静脉(动脉)、腹主动脉、眼球的血等。由于全血的稳定性差,存在异质性,所以一般检测中避免使用全血而选用血浆或血清。血浆是在全血中加入EDTA、肝素钠等抗凝剂防止纤维蛋白原凝固,血清是不加抗凝剂的全血在室温下放置30min自然凝固后,通过离心分离出的上清液。最后需检查血浆或血清是否有溶血,溶血会引起鸟氨酸、柠檬酸、苯丙氨酸等多种代谢物的改变,如果发生溶血需要重新采样。


      1) 血浆的制备


      用含有抗凝剂的采血管采集血液,采血后立即轻轻颠倒混匀采血管5-10次,确保抗凝剂发挥作用,采血后需要在30min内尽快离心分离出血浆(如不能尽快离心,需放在4℃冰箱保存,并且在2h内完成离心和分装,4℃条件下离心10min左右,离心力为1500g,取出采血管置试管架中,吸取上清液(血浆)200ul/例(不同项目类型送样量不同,如下表)置于已编号的EP管中,如此重复分装成多管血浆, 避免反复冻融,尽快将血浆保存于-80℃冰箱中。

      2) 血清的制备

      用不加抗凝剂的采血管采集血样,室温下放置30min凝血结束后,4℃条件下离心10min左右,离心力为1500g,取出采血管置试管架中,吸取上清液(血清)200ul/例(不同项目类型送样量不同,如下表)置于已编号的EP管中,如此重复分装成多管血清,避免反复冻融,尽快将血清保存于-80℃冰箱中。


项目类型

样本类型

建议送样量

最低送样量

GC-MS非靶

血浆/血清

300uL

150uL

LC-MS非靶

血浆/血清

200uL

100uL

脂肪酸

血浆/血清

200uL

100uL

短链脂肪酸

血浆/血清

300uL

150uL

氨基酸

血浆/血清

100uL

50uL

神经递质

血浆/血清

250uL

125uL

胆汁酸

血浆/血清

250uL

125uL

TMAO

血浆/血清

250uL

125uL



      2. 尿液的制备


      尿液样本主要分为临床尿液和实验动物尿液,临床尿液主要采晨尿、随机尿、计时尿(3小时尿、餐后尿和24小时尿)、导管尿、耻骨上穿刺尿等;实验动物尿液采集方法主要包括挤压膀胱、代谢笼收集、导尿管插管、输尿管插管、穿刺膀胱方法等。取尿液,静置在4℃保存,4℃条件下离心10min左右,离心力为1500g,吸取上清液(尿液)250ul/例(不同项目类型送样量不同,如下表)置于已编号的EP管中,如此重复分装成多管,避免反复冻融,尽快将尿液保存于-80℃冰箱中。


项目类型

样本类型

建议送样量

最低送样量

GC-MS非靶

尿液

250uL

125uL

LC-MS非靶

尿液

200uL

100uL

氨基酸

尿液

100uL

50uL



      3. 粪便的制备


      1) 人粪便样本的采集

      采集前先排尿。患者将粪便排于清洁、干燥、无吸水性的容器内,用小勺分别取两端和中部的内外部的粪便样本。采集粪便后,放入做好标记的冻存管中,样本量需要300mg/例(不同项目类型送样量不同,如下表),立即置于液氮中速冻;速冻后转运储存于液氮罐或-80℃冰箱中。

      2) 小鼠/大鼠粪便样本的采集

      动物粪便样本采集主要有自然排便法和肠道提取法。自然排便法是将实验动物置于代谢笼中,1只/笼,收集12h或24h粪便;肠道提取法是处死动物后,剖开腹腔,分离肠道,剪取大肠、盲肠、结肠或直肠提取内容物。采集粪便后(不同项目类型送样量不同,如下表),放入做好标记的冻存管中,立即置于液氮中速冻;速冻后转运储存于液氮或-80℃冰箱中。


项目类型

样本类型

建议送样量

最低送样量

GC-MS非靶

粪便

300mg

150mg

LC-MS非靶

粪便

300mg

150mg

脂肪酸

粪便

200mg

100mg

短链脂肪酸

粪便

300mg

150mg

氨基酸

粪便

100mg

50mg

神经递质

粪便

300mg

150mg

胆汁酸

粪便

300mg

150mg

TMAO

粪便

300mg

150mg

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      4. 组织的制备


      切割下目标组织样本,用生理盐水清洗残留血液,滤纸吸干表面液体。在冰上将组织样本切割成20~50mg左右的小块,采用铝箔纸包括组织块,置于液氮中速冻约10s,在组织切除和处理30min内进行速冻。将速冻后的组织块分装至冻存管中,样本量需要200mg/例(不同项目类型送样量不同,如下表),速冻后的组织转运储存于液氮或-80℃冰箱中。


项目类型

样本类型

建议送样量

最低送样量

GC-MS非靶

动物组织

200mg

100mg

LC-MS非靶

动物组织

200mg

100mg

脂肪酸

动物组织

200mg

100mg

短链脂肪酸

动物组织

200mg

100mg

氨基酸

动物组织

100mg

50mg



      5. 细胞的制备


      样本量要求是细胞个数≥107/例(如下表),细胞样本可分为贴壁细胞和悬浮细胞,贴壁细胞是取对数生长期细胞,去掉培养液,用适量预冷PBS清洗两遍,再加入少量PBS,用细胞铲刮下细胞,置于1.5mL离心管中,在1000g,4℃离心1min。悬浮细胞是取对数生长期细胞液,在1000g,4℃离心1min,去掉培养液,使用预冷PBS清洗细胞两遍,置于1.5mL离心管中,在1000g离心1min。收集到的细胞储存于液氮或-80℃冰箱中。


项目类型

样本类型

建议送样量

最低送样量

GC-MS非靶

细胞

107

5*106

LC-MS非靶

细胞

107

5*106

脂肪酸

细胞

107

5*106

氨基酸

细胞

107

5*106


      6. 唾液的制备

      样本量要求是1ml/例(如下表)。采集唾液前至少1h内不要抽烟、不吃东西、不喝水、不刷牙。采集前纯净水清洁口腔,采集自然状态下不受刺激分泌的唾液1ml左右。采集样本后在4℃下1500g离心15分钟,吸取上清,置于液氮或-80℃冰箱中储存。


项目类型

样本类型

建议送样量

最低送样量

GC-MS非靶

唾液

1ml

0.5ml

LC-MS非靶

唾液

1ml

0.5ml

氨基酸

唾液

1ml

0.5ml



      7. 植物样本的采集


      根据研究需求选择植物样本合适的采集部位,精确采集相应的部位,不同部位的样本量不同(如下表)。利用洁净的剪刀剪下所需部位,去离子水清洁样本表面杂质,滤纸吸干,不同的部位要分开置于冻存管中,并做好标记。分装至冻存管后应立即竖直置于液氮中速冻,速冻时间约30s。速冻后转运储存于液氮或-80℃冰箱中。


项目类型

样本类型

建议送样量

最低送样量

GC-MS非靶/ LC-MS非靶/靶向

植物叶片

2g

1g

植物根茎

1g

0.5g

植物果实

询问

询问


      8. 微生物的制备

      样本量要求是120mg菌体/例(如下表)。采集适量菌液置于无菌离心管中,在4000g,4℃下离心3min,分离菌体,用预冷PBS溶液清洗菌体两遍,4000g,4℃下离心3min,分离得到菌体,储存于液氮或-80℃冰箱中。


项目类型

样本类型

建议送样量

最低送样量

GC-MS非靶/ LC-MS非靶/靶向

微生物

120mg菌体

60mg菌体



      以上是常见样本制备要求的总结,您还可以扫描下方二维码,或点击文章底部“阅读原文”,关注帕诺米克代谢组学订阅号,回复“样本制备”,获取详细的样本制备流程 


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